J. Nanobiotechnol. | 农业新希望：氧化石墨烯为花生抗盐增产带来曙光

文章标题：Seed priming with graphene oxide improves salinity tolerance and increases productivity of peanut through modulating multiple physiological processes

期刊：Journal of Nanobiotechnology

合作单位：青岛农业大学

百趣提供服务：新一代代谢组学NGM 2、转录组学

花生是豆科植物的典型代表，种植范围较广，且富含不饱和脂肪酸，对人类心血管有益，但高盐环境会严重限制花生根系生长、根瘤菌发育、氮固定能力和产量。目前种子引发是一种显著的土壤碱化管理策略，引种物质可刺激种子萌发的生理和信号过程，并在不污染土壤的情况下提高植物生长后期的耐盐性。已有研究报道：氧化石墨烯(Graphene oxide, GO)通过调节养分同化促进植物生长，清除活性氧减少膜脂过氧化等功能来应对植物非生物胁迫响应，然而，人们对非转基因物质在种子引种中的作用机制知之甚少。非转基因物质GO能否作为潜在的种子引发候选物质来应对作物盐分胁迫的问题，目前尚不清楚。本文通过花生生长和田间生长试验，从生理、转录和代谢组学等方面探究盐胁迫下GO对花生种子萌发、幼苗生长和生产中的作用，为在可持续农业背景下利用纳米材料(nanomaterials, NMs)增强豆科植物的抗盐性和提高生产力提供指导。

首先利用扫描电镜和拉曼光谱对花生种子中GO的形态和质地进行表征，实验I（种子萌发实验）中，种子中的GO表现出堆叠和折叠的形式，具有层状结构；拉曼光谱显示GO具有代表性D和G峰（图1B）。在实验II（盆栽实验）中，GO的代表性D和G峰仅在花生茎和根中被检测到。这些结果表明，种子引发是花生苗期积累GO的有效方法。

图1. 实验设计及GO在花生种子和幼苗中的特性

为探究GO在种子萌发阶段对花生种子萌发的影响，首先进行了种子萌发实验，结果发现在种子萌发的6天中，GO诱导的种子带有突破种皮的自由基的百分比(percentage of seeds with radicals breaking through testa, PSWRB)在第1天明显增加，发芽率在第5-6天显著提高（图2A-B）。接着，利用转录组学技术阐明与GO相关基因的表达水平，分析显示与对照组（CK）组相比，GO处理的花生种子共检测到1703个差异基因(differentially expressed genes, DEG)，其中有935个基因上调，768个基因下调（图2C）。KEGG富集分析显示这些差异基因主要与代谢过程有关，包括淀粉和蔗糖代谢、三羧酸循环以及甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢等途径；黄酮类生物合成和苯丙类生物合成等次生代谢过程也被富集（图2D）；基因本体(Gene Ontology, GO)富集分析显示细胞内信息交换和蛋白质加工也被富集（图2C）。这表明GO诱导可能影响种子的初级代谢和次级代谢，从而可能促进种子萌发。

图2. 氧化石墨烯促进了花生种子的萌发

利用非靶代谢组学阐明氧化石墨烯对花生种子代谢物谱的影响，主成分分析(Principal component analysis, PCA)显示同组生物学重复样品聚集，GO组和CK组间明显分离（图3B）。与CK组相比，GO处理的种子共有64个差异代谢物(differentially accumulated metabolites, DAMs)，其中36个代谢物上调，28个代谢物下调，这些差异代谢物主要为生物碱、氨基酸、苯类和有机酸（图3A）。KEGG富集分析显示GO诱导花生种子与氨基酸代谢和次级代谢物生物合成相关的途径有关（图3C）。

图3. 氧化石墨烯处理花生种子DAMs的动态变化

为探究GO诱导对花生幼苗耐盐性的影响。首先进行盆栽实验，结果发现单独GO处理对花生生长发育的影响较小，而在盐胁迫下，GO诱导改善了花生幼苗高度、根长和鲜重增加（图4A-C）。接着对每种处理的花生幼苗进行了转录组学测序和非靶代谢组学检测，结果表明GO+NaCl vs. CK和NaCl vs. CK之间共有991个DEGs，KEGG富集分析揭示了DEGs与氮利用、次生代谢和植物激素的有关。代谢组学结果中，PCA分析显示CK和GO组更密切相关，而NaCl和GO+NaCl组表现出不同的代谢特征，这与表型结果一致。KEGG富集分析表明这些差异代谢物的功能主要与蛋白质、糖和植物激素相关。

通过检测幼苗根的氮、磷和钾含量来探究GO是否会影响盐胁迫下的养分吸收。结果表明，与单独的盐胁迫相比，GO诱导增加了根中氮、磷和钾含量（图4D）。负责氮吸收的NRT 2转运蛋白在NaCl组表达最高，GLU和GLUD1_2表达在GO+NaCl组中更高，这使谷氨酸水平恢复（图4E）。

最后分析了与生长激素和应激反应激素相关的基因表达和含量。与植物激素相关基因中，赤霉素途径中的上游限速酶KAO和GA20ox在盐胁迫下降低，而GO诱导部分恢复了它们的表达。盐胁迫抑制了GA3ox的表达，但GO诱导上调GA3ox表达（图4F）。生长激素也观察到类似的模式，盐胁迫下IAA前体-L-色氨酸的含量最低，而GO诱导部分恢复其含量，同时IAA合成的关键酶ALDH和YUCCA在GO+NaCl中表达升高（图4H）。在应激反应激素中，在盐胁迫下细胞分裂素前体DMAPP积累，而下游关键酶IPT的表达减弱，最终细胞分裂素含量降低。总的来说，单独GO诱导对花生幼苗生长的影响有限，但它通过调节氮同化和植物激素代谢来增强耐盐性。

图4. GO通过促进植物生长缓解花生盐胁迫

通过检测根系中糖和氨基酸的含量，探究GO诱导对花生耐盐性的影响。结果显示，GO+NaCl组中可溶性糖和蔗糖含量降低，游离氨基酸的含量升高（图5A），因此推测GO诱导有助于维持盐胁迫下花生根系的渗透压，从而提高耐盐性。GO+NaCl组中参与D-果糖合成相关基因（INV和malZ）的表达水平降低（图5B）。相反，负责D-葡萄糖合成的基因的表达升高。GO+NaCl组中与海藻糖合成相关的TPS和ostB（其可以在高渗透环境中保护细胞）上调。GO诱导改善了不溶性淀粉糖的合成（图5B）。由此可知GO诱导影响盐胁迫下花生的碳代谢和渗透调节。

图5. GO通过调节碳代谢缓解花生盐胁迫

接着，进一步研究了GO诱导在盐胁迫下花生光合系统调节中的作用（图6A）。在无胁迫条件下，GO诱导对Fv/Fm和Pn影响较小，但总叶绿素含量增加；在盐胁迫下，土壤盐渍化降低Fv/Fm、Pn和总叶绿素含量，而GO诱导改善了此现象（图6C-E）。GO诱导也提高叶绿素荧光参数（ΦPSII、Fv'/Fm'和ETR）而降低了NPQ（图6F）。RNA-seq分析发现在无胁迫和盐胁迫条件下，GO诱导都能提高光合链组分中关键基因的表达量（如LHCII，光系统II，细胞色素b6/f复合物，光系统I，LHCI，和F-型ATP酶）（图6B）。这些结果证明，GO诱导的花生盐胁迫缓解效应与光合系统的强化有关。

图6. GO通过调节光系统缓解花生盐胁迫

为探究GO诱导对盐胁迫下花生抗氧化系统的调节作用，首先测定了盐胁迫下花生抗氧化关键酶的活性。单独GO处理提高了超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)和愈创木酚过氧化物酶(guaiacol peroxidase, G-POD)的活性，在盐胁迫下，GO诱导提高SOD、抗坏血酸过氧化物酶(ascorbate peroxidase, APX)和过氧化氢酶(catalase, CAT)活性。活性氧(reactive oxygen species, ROS)的组织化学染色和数量检测也表明GO诱导减少了盐分胁迫下花生叶片中H2O2和O2-的积累（图7A）。GO诱导的幼苗在盐胁迫下丙二醛(malondialdehyde, MDA)含量降低（图7B）。在无胁迫下，GO组和CK组的相对含水量(The relative water content, RWC)和相对电解质电导率(the relative electrolyte conductivity, REC)没有差异。在胁迫条件下，GO诱导显著提高RWC，降低REC。此外，在GO和CK组间的花生叶亚细胞结构中没有差异；然而，盐胁迫导致细胞质膜、线粒体和叶绿体严重损伤，GO诱导缓解了盐引起的质膜损伤，并维持了类囊体和质膜的完整性（图7C）。

图7. GO通过维持抗氧化系统和质膜完整性缓解花生盐胁迫

最后探究了在田间生长条件下GO诱导在花生生产力中的潜在作用。在2022年和2023年，GO诱导处理的花生荚果产量提高，但每公顷株数差异不显著；然而与CK相比，GO诱导显著增加荚果重量和荚果数量（表1）。

表1 GO对花生产量及产量构成因素的影响

本文基于转录组学和非靶代谢组学技术，阐明GO诱导主要通过模拟氨基酸和次生代谢产物的生物合成来提高花生种子的发芽率和PSWRB。此外，当幼苗受到盐胁迫时，GO诱导能促进花生幼苗生长，还能提高花生叶片的Pn、Fv/Fm、ΦPSII和叶绿素含量，增强抗氧化酶SOD、APX和CAT活性，从而降低盐胁迫下的MDA含量和相对电解质电导率(relative electrolyte conductivity, REC)，维持质膜完整性。GO诱导还模拟植物激素的生物合成，并调节花生根中碳、氮代谢，从而导致游离氨基酸和养分过度积累来应对盐胁迫。最后通过大田试验验证了GO诱导能提高花生荚果产量（图8）。尽管如此，有关GO诱导促进花生荚果产量形成的机制，仍有待进一步阐明；此外，未来有关GO诱导的分子生物学研究的研究可以更全面地了解GO与豆科作物的相互作用。

图8. GO促进花生种子萌发和增强幼苗耐盐性机制